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微生物菌种的存活率及活性的检测方法pdf


来源:澳门葡京      发布时间:2019-11-26 08:03     点击率:

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  10申请公布号CN102051404A43申请公布日20110511CN102051404ACN102051404A21申请号申请日20091103C12Q1/06200601C12R1/42200601C12R1/0120060171申请人中国检验检疫科学研究院地址100123北京市朝阳区高碑店北路甲3号申请人袁飞72发明人袁飞陈颖徐宝梁赵贵明张菲菲杨海荣赵勇胜74专利代理机构隆天国际知识产权代理有限公司72003代理人吴小瑛吕俊清54发明名称微生物菌种的存活率及活性的检测方法57摘要本发明公开了一种微生物菌种的存活率及活性的检测方法,其包括如下步骤A将微生物菌种溶解在含有噻唑蓝的培养液中,并进行稀释得到菌悬液;B将不同稀释梯度的菌悬液加入到培养板的各孔中;和C实时扫描测定,根据扫描结果计算菌种的存活率、判断菌种的活性。利用本发明的检测方法可便捷、快速和高效地定期检测保存的微生物菌种的存活率及活性。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图1页CN102051410A1/1页21一种微生物菌种的存活率及活性的检测方法,其包括如下步骤A将微生物菌种溶解在含有噻唑蓝的培养液中,并进行稀释得到菌悬液;B将不同稀释梯度的菌悬液加入到培养板的各孔中;和C实时扫描测定,根据扫描结果计算菌种的存活率、判断菌种的活性。2根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述步骤A中的培养液为脑心浸液培养液。3根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述步骤B中的菌悬液的稀释梯度为10倍梯度。4根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述步骤C中的存活率是参考大肠菌群最可能数检索表,确定保存菌种中的活菌数量,再将该活菌数量除以菌种开始保存时的活菌数量,从而得到存活率。5根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括以下步骤将噻唑蓝用PBS配置成5±05%的储备液,灭菌,冰箱保存;将噻唑蓝储备液加入脑心浸液培养液中,使其终浓度达到01±005%,灭菌,冰箱保存备用;将含有噻唑蓝的脑心浸液加入到培养板的各孔中;将菌种用脑心浸液培养液溶解后,用无菌水进行10倍梯度系列稀释;将各稀释度的菌悬液加入微孔中;将微孔板放入酶标仪中,将培养温度设定为36℃,测定波长为520NM,使用动力学测定模式,每隔一段时间测定1次,连续测定一定时间;根据扫描结果计算菌种的存活率、判断菌种的活性。6根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括以下步骤将噻唑蓝用PBS配置成5±05%的储备液,灭菌,4℃冰箱保存;将噻唑蓝储备液加入脑心浸液培养液中,使其终浓度达到01±005%,灭菌,4℃冰箱保存备用;将含有噻唑蓝的脑心浸液加入到96孔培养板的各孔中;将菌种用脑心浸液培养液溶解后,用无菌水进行10倍梯度系列稀释到108;将101108稀释度的菌悬液加入微孔中;将微孔板放入酶标仪中,将培养温度设定为36℃,测定波长为520NM,使用动力学测定模式,每隔30分钟测定1次,连续测定24小时;以测定时间为X轴,以吸收值为Y轴,作每孔的时间吸收曲线;根据曲线判断菌种活性;参考大肠菌群最可能数检索表,确定保存菌种中的活菌数量,再将该活菌数量除以菌种开始保存时的活菌数量,得到菌种的存活率。权利要求书CN102051404ACN102051410A1/8页3微生物菌种的存活率及活性的检测方法技术领域0001本发明属于生物技术领域,涉及一种微生物菌种的存活率及活性的检测方法,特别是涉及一种采用实时扫描微生物生长而快速测定菌种的存活率及活性的方法。背景技术0002微生物菌种的保存是一项非常重要的工作,在科研和检测过程中有研究价值的微生物菌种都需要保存下来,并且还有很多专业机构专门从事微生物菌种的保存工作。微生物菌种采用不同的保护剂,经过不同的方式保存。保存起来后,每隔一段时间就需要对菌种进行抽样,并测定抽取菌种的存活率及活性,然后根据存活率及活性情况确定是否可以继续保存,或需要复壮后重新保存。该项测定工作,工作量大,并要求实验重复性好。0003微生物菌种存活率测定,即将微生物菌种复活后,进行计数;微生物菌种活性测定,通常是将菌种复活后,培养一段时间,定期取样计数,测定其生长曲线。两种测定都需要进行微生物计数,目前计数方法除了传统的活菌染色显微镜计数、平板计数等方法外,还有浊度法和噻唑蓝MTT法。前两种传统方法,耗时长,操作繁琐,在大规模、重复性测定中更加显得很不方便。浊度法,其原理是细菌生长,浊度增加。但是,由于浊度的分辨率较低,且不同微生物数量与浊度的关系也不同,因此常常发生以下两个问题一是,菌悬液浊度很低,但是实际菌悬液中微生物数量已经大量增值;二是,虽然两种菌浊度数值非常相近,但是实际菌悬液中两种菌的数量相差3个数量级以上,从而造成浊度法计数微生物时出现浊度与微生物数量不一致情况,因此在大规模、重复性测定中一般使用得较少。0004MTT法克服了浊度法的缺点,其原理是在微生物生长一段时间后,加入MTT和二甲基亚砜,终止反应,产生蓝色,测定520NM处吸收,其吸收值与微生物数量成正比。但,目前采用的MTT法均采用终点法检测,且通过建立的标准曲线进行定量,实验操作繁琐,且无法实现快速的实时检测。0005因此,本领域需要一种更为简便、快速的测定菌种存活率和活性的方法。发明内容0006本发明的目的在于提供一种微生物菌种存活率及活性的检测方法,应用这种方法可快速、简便地检测菌种的存活率及活性,根据检测结果,如果菌种存活率高、活性好,则该菌种可以继续保存,如果菌种存活率低或活性低,则可以通过复壮措施提高其存活率和活性,重新保存。0007为实现上述目的,本发明提供了一种微生物菌种的存活率及活性的检测方法,其包括如下步骤0008A将微生物菌种溶解在含有噻唑蓝的培养液中,并进行稀释得到菌悬液;0009B将不同稀释梯度的菌悬液加入到培养板的各孔中;和0010C实时扫描测定,根据扫描结果计算菌种的存活率、判断菌种的活性。0011由于只要有活菌存在,经过培养就能使噻唑蓝产生蓝色物质,因此可根据出现吸说明书CN102051404ACN102051410A2/8页4收峰的孔的情况,确定发生生长的最低3个稀释度和发生生长的孔数,例如可通过参考大肠菌群最大可能数MPN检索表,确定菌种中活菌数量。将得到的保存菌种中的活菌数量除以菌种原先的活菌数量,可计算得出存活率。0012由于吸收值与菌种生长情况成正比,因此可根据实时扫描获得的时间吸收曲线形状判断微生物菌种生长活性。生长曲线可分为三种类型陡峭型、中间型、平缓型。陡峭型,延滞期短,对数期几乎呈直线上升,稳定期维持在较高的吸收值,且持续时间长;中间型,延滞期长,对数期缓慢上升,稳定期维持在较低的吸收值,且持续时间短,很快进入衰亡期;平缓型,整个曲线呈抛物线型或贴近X轴呈直线,一直维持较低的吸收值。活性好的菌种为陡峭型生长曲线;活性差的菌种为中间型或平缓型生长曲线。同一菌种不同稀释度的各孔的生长曲线,延滞期长短有差别,但是此后对数期的生长斜率和稳定期的吸收值基本一致,从而可以根据生长曲线的类型确定菌种的活性。0013本方法计数的原理是在含有MTT的培养基中加入多个如8个梯度稀释如10倍梯度稀释的菌悬液,每个菌株重复数次如3次,培养24小时后,确定发生生长的最低几个如3个稀释度和发生生长的孔数出现吸收峰的孔表示该稀释度有生长,参考大肠菌群最可能数MPN检索表,确定菌种中活菌数量。将本方法得到的保存菌种中的活菌数量,除以菌种原先的活菌数量,可计算得出存活率。0014本方法测定活性的原理是,菌种接种到各孔如96孔中后,培养24小时,随着孔中活菌数量的增加,蓝色逐渐加深,其间实时扫描,测定各孔的吸收值,做时间吸收曲线,用于表征菌种的生长情况。在高等动物细胞中,MTT被线粒体中的脱氢酶还原成蓝色FOMAZAN颗粒,因此在进行高等动物细胞数量和活性测定时,必须加入二甲基亚砜,使形成的FOMAZAN颗粒能均匀溶解在细胞悬液中。而在细菌细胞中,琥珀酸脱氢酶存在于质膜和间体中,MTT被细菌活细胞的琥珀酸脱氢酶利用后产生FOMAZAN颗粒,很容易扩散到菌悬液中,且在一定范围内,FOMAZAN颗粒形成的量并与细菌细胞脱氢酶活性有关,也与细菌细胞数量成正比。因此,在细菌生长测定时,可以采取实时扫描方法,连续测定时间吸收曲线,吸收值的高低与细菌数量成正比,因此可以用该曲线根据本发明的微生物菌种的存活率及活性的检测方法,所述步骤A中的培养液优选为脑心浸液培养液。所述步骤B中的菌悬液的稀释梯度为10倍梯度。所述步骤C中的存活率是参考大肠菌群最可能数检索表,确定保存菌种中的活菌数量,再将该活菌数量除以菌种开始保存时的活菌数量,从而得到存活率。0016根据本发明的检测方法的一个实施方式,所述检测方法包括以下步骤0017将噻唑蓝用PBS配置成5±05%的储备液,灭菌,冰箱保存;将噻唑蓝储备液加入脑心浸液培养液中,使其终浓度达到01±005%,灭菌,冰箱保存备用;将含有噻唑蓝的脑心浸液加入到培养板的各孔中;将菌种用脑心浸液培养液溶解后,用无菌水进行10倍梯度系列稀释;将各稀释度的菌悬液加入微孔中;将微孔板放入酶标仪中,将培养温度设定为36℃,测定波长为520NM,使用动力学测定模式,每隔一段时间测定一次,连续测定一定时间;根据扫描结果计算菌种的存活率、判断菌种的活性。0018根据本发明的检测方法的一个实施方式,所述检测方法包括以下步骤将噻唑蓝用PBS配置成5±05%的储备液,灭菌,4℃冰箱保存;将噻唑蓝储备液加入脑心浸液培养液中,使其终浓度达到01±005%,灭菌,4℃冰箱保存备用;将含有噻唑蓝的脑心浸液加说明书CN102051404ACN102051410A3/8页5入到96孔培养板的各孔中;将菌种用脑心浸液培养液溶解后,用无菌水进行10倍梯度系列稀释到108;将101108稀释度的菌悬液加入微孔中;将微孔板放入酶标仪中,将培养温度设定为36℃,测定波长为520NM,使用动力学测定模式,每隔30分钟测定1次,连续测定24小时;以测定时间为X轴,以吸收值为Y轴,作每孔的时间吸收曲线;根据曲线判断菌种活性;参考大肠菌群最可能数检索表,确定保存菌种中的活菌数量,再将该活菌数量除以菌种开始保存时的活菌数量,得到菌种的存活率。0019对于本发明所述的微生物菌种存活率及活性的检测方法,在测定菌种存活率时,可将MPN法与噻唑蓝显色相结合,用于测定菌种中的活菌数量。与浊度法相比,具有更好的特异性;与传统方法相比,操作更简便,使用的试剂更少更经济。此外,可利用扫描仪通过实时扫描获得微生物曲线,通过曲线的形状可判断微生物活性,与传统的微生物活性检测方法相比具有更简便、更经济的优点。0020也就是说,本发明提供的微生物菌种存活率及活性的测定方法是通过实时扫描监控菌种在培养液中的生长情况,从而定量测定其中的活菌数量,定性判断活菌的活性。0021本发明尤其适宜于微生物菌种存活率及活性的快速测定,如发现菌种存活率高,活性好,则可以继续保存,如发现菌种存活率低,活性差,可通过菌种复壮手段,重新保存菌种。0022按照本发明所述的检测方法的一个实施方式,该方法采用以下简单过程微生物菌种溶解在脑心浸液培养基中将菌悬液进行10倍梯度稀释将含有MTT的脑心浸液培养基加入到96孔培养板将不同稀释梯度的菌悬液加入到各孔中实时扫描测定根据出现吸收峰的情况查MPN表,计算菌种中的活菌数;根据时间吸收曲线形状,判断菌种的活性情况。微生物菌种溶解到脑心浸液培养液中除了少部分营养要求特殊的微生物,绝大多数微生物菌种都能在营养丰富的脑心浸液培养液中生长繁殖,随着微生物的生长繁殖,产生琥珀酸脱氢酶,分解MTT,产生蓝色的FOMAZAN。在520NM波长下测定光强度,作微生物时间吸收生长曲线,根据出现吸收峰的孔的情况,确定发生生长的最低3个稀释度和发生生长的孔数,参考大肠菌群最可能数MPN检索表,确定菌种中活菌数量,将本方法得到的保存菌种中的活菌数量,除以菌种原先的活菌数量,可计算得出存活率;根据时间吸收曲线形状判断微生物菌种生长活性。如发现微生物菌种存活率与上次检测结果相比骤降,或者存活率低于50%,或生长曲线呈中间型和平缓型,则微生物菌种存活率和活性出现问题,需要通过菌种复壮手段,复壮菌种后重新保存;如发现微生物菌种存活率高于50%,且与上次检测结果相比变化不显著,且生长曲线呈陡峭型,则微生物菌种存活率和活性高,可继续保存。0023本发明虽然也采用MTT指示微生物生长,但是使用了多孔板培养微生物,并实时扫描测定含有MTT的培养液的吸光值变化,从而简化了实验操作,提高了检测效率。使用本微生物菌种存活率及活性实时扫描测定方法,能够便捷、快速和高效地定期检测保存的菌种的存活率及活性。附图说明0024图1为经过1年保存的阪崎肠杆菌菌种实时生长图谱。说明书CN102051404ACN102051410A4/8页6具体实施方式0025以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明,但本发明并不限于这些实施例。0026实施例0027本实施例以举例说明的方式对一些菌种进行了实时扫描测定,但本发明的范围并不限于本实施例。0028将噻唑蓝用PBS配置成5%的储备液,灭菌,4℃冰箱保存。将噻唑蓝储备液加入脑心浸液培养液,使其终浓度达到01%,灭菌,4℃冰箱保存备用。将180ΜL含有噻唑蓝的脑心浸液加入到96孔培养板的每一孔中。打开菌种管,将菌种用脑心浸液培养液溶解后,用无菌水进行10倍梯度系列稀释到108。按列加入101108稀释度的菌悬液20ΜL到微孔中,每个稀释度重复3次,即1株菌种3列;每块微孔板12列,可实现4株菌种的检测。盖上微孔板盖子,将微孔板放入酶标仪中,将培养温度设定为36℃,测定波长为520NM,使用动力学测定模式,每隔30分钟测定1次,连续测定24小时。以测定时间为X轴,以吸收值为Y轴,作每孔的时间吸收曲线。如有相应软件,可直接采用软件,制作生长曲线。由于只要有活菌存在,经过培养就能使噻唑蓝产生蓝色物质,因此可根据出现吸收峰的孔的情况,确定发生生长的最低3个稀释度和发生生长的孔数,参考大肠菌群最可能数MPN检索表,确定菌种中活菌数量。将本方法得到的保存菌种中的活菌数量,除以菌种原先的活菌数量,可计算得出存活率。由于吸收值与菌种生长情况成正比,因此可根据时间吸收曲线形状判断微生物菌种生长活性。生长曲线可分为三种类型陡峭型、中间型、平缓型。陡峭型,延滞期短,对数期几乎呈直线上升,稳定期维持在较高的吸收值,且持续时间长;中间型,延滞期长,对数期缓慢上升,稳定期维持在较低的吸收值,且持续时间短,很快进入衰亡期;平缓型,整个曲线呈抛物线型或贴近X轴呈直线,一直维持较低的吸收值。活性好的菌种为陡峭型生长曲线;活性差的菌种为中间型或平缓型生长曲线。同一菌种不同稀释度的各孔的生长曲线,延滞期长短有差别,但是此后对数期的生长斜率和稳定期的吸收值基本一致。从而可以根据生长曲线的类型确定菌种的活性。如发现微生物菌种存活率与上次检测结果相比骤降,或者存活率低于50%,或生长曲线呈中间型和平缓型,则微生物菌种存活率和活性出现问题,需要通过菌种复壮手段,复壮菌种后重新保存;如发现微生物菌种存活率高于50%,且与上次检测结果相比变化不显著,且生长曲线呈陡峭型,则微生物菌种存活率和活性高,可继续保存。0029按照本实施例描述的方法对表1所列菌种进行实时扫描测定,菌种的存活率示于表1中;一些菌种的实时生长图谱示于附图中。0030图1为经过1年保存的阪崎肠杆菌菌种实时生长图谱变化情况,其中图1A为保存前的实时生长图谱其中A1、B1、C1~A6、B6、C6,D1、D2、D3分别为IQCC1040320、IQCC10424、IQCC10434、IQCC10439、IQCC10456、IQCC10481、IQCC10486,图1B为保存1年后的生长图谱其中A1、B1、C1~A6、B6、C6,D1、D2、D3分别为IQCC10424、IQCC10434、IQCC10439、IQCC10456、IQCC10481、IQCC10486、IQCC1040320。比较图A和图B中阪崎肠杆菌的生长曲线,发现延滞时间,对数生长期斜率和稳定生长期吸收值均差异不显著,因此判定该菌种经过一年的保存活性没有受到影响。0031表1保存1年后菌种的存活率说明书CN102051404ACN102051410A5/8页700320033说明书CN102051404ACN102051410A6/8页80034说明书CN102051404ACN102051410A7/8页90035说明书CN102051404ACN102051410A8/8页100036将本方法得到的保存菌种中的活菌数量除以菌种开始保存时的活菌数量,可计算得出存活率。一般细菌开始保存时的活菌数量通常为108CFU/ML~109CFU/ML,经过保存后,与开始保存时的细菌数量相比,当细菌数量仍为同一数量级,则认为存活率100%;当细菌数量减少一个数量级则认为存活率>10%;当细菌数量减少两个或以上数量级则认为存活<10%;当细菌全数死亡,则认为存活率为0%。0037可见,与现有技术相比,本发明可便捷、快速和高效地定期检测保存的微生物菌种的存活率及活性。说明书CN102051404ACN102051410A1/1页11图1说明书附图CN102051404A

  本发明公开了一种微生物菌种的存活率及活性的检测方法,其包括如下步骤:A.将微生物菌种溶解在含有噻唑蓝的培养液中,并进行稀释得到菌悬液;B.将不同稀释梯度的菌悬液加入到培养板的各孔中;和C.实时扫描测定,根据扫描结果计算菌种的存活率、判断菌种的活性。利用本发明的检测方法可便捷、快速和高效地定期检测保存的微生物菌种的存活率及活性。

  1: 一种微生物菌种的存活率及活性的检测方法, 其包括如下步骤 : A. 将微生物菌种溶解在含有噻唑蓝的培养液中, 并进行稀释得到菌悬液 ; B. 将不同稀释梯度的菌悬液加入到培养板的各孔中 ; 和 C. 实时扫描测定, 根据扫描结果计算菌种的存活率、 判断菌种的活性。

  2: 根据权利要求 1 所述的检测方法, 其特征在于, 所述步骤 A 中的培养液为脑心浸液培 养液。

  3: 根据权利要求 1 所述的检测方法, 其特征在于, 所述步骤 B 中的菌悬液的稀释梯度为 10 倍梯度。

  4: 根据权利要求 1 所述的检测方法, 其特征在于, 所述步骤 C 中的存活率是参考大肠菌 群最可能数检索表, 确定保存菌种中的活菌数量, 再将该活菌数量除以菌种开始保存时的 活菌数量, 从而得到存活率。

  5: 根据权利要求 1 所述的检测方法, 其特征在于, 所述检测方法包括以下步骤 : 将噻唑蓝用 PBS 配置成 5±0.5 %的储备液, 灭菌, 冰箱保存 ; 将噻唑蓝储备液加入脑 心浸液培养液中, 使其终浓度达到 0.1±0.05%, 灭菌, 冰箱保存备用 ; 将含有噻唑蓝的脑 心浸液加入到培养板的各孔中 ; 将菌种用脑心浸液培养液溶解后, 用无菌水进行 10 倍梯度 系列稀释 ; 将各稀释度的菌悬液加入微孔中 ; 将微孔板放入酶标仪中, 将培养温度设定为 36 ℃, 测定波长为 520nm, 使用动力学测定模式, 每隔一段时间测定 1 次, 连续测定一定时 间; 根据扫描结果计算菌种的存活率、 判断菌种的活性。

  6: 根据权利要求 1 所述的检测方法, 其特征在于, 所述检测方法包括以下步骤 : 将噻唑 蓝用 PBS 配置成 5±0.5%的储备液, 灭菌, 4℃冰箱保存 ; 将噻唑蓝储备液加入脑心浸液培 养液中, 使其终浓度达到 0.1±0.05%, 灭菌, 4℃冰箱保存备用 ; 将含有噻唑蓝的脑心浸液 加入到 96 孔培养板的各孔中 ; 将菌种用脑心浸液培养液溶解后, 用无菌水进行 10 倍梯度系 -8 -1 -8 列稀释到 10 ; 将 10 -10 稀释度的菌悬液加入微孔中 ; 将微孔板放入酶标仪中, 将培养温 度设定为 36℃, 测定波长为 520nm, 使用动力学测定模式, 每隔 30 分钟测定 1 次, 连续测定 24 小时 ; 以测定时间为 X 轴, 以吸收值为 Y 轴, 作每孔的时间 - 吸收曲线 ; 根据曲线判断菌 种活性 ; 参考大肠菌群最可能数检索表, 确定保存菌种中的活菌数量, 再将该活菌数量除以 菌种开始保存时的活菌数量, 得到菌种的存活率。

  技术领域 本发明属于生物技术领域, 涉及一种微生物菌种的存活率及活性的检测方法, 特 别是涉及一种采用实时扫描微生物生长而快速测定菌种的存活率及活性的方法。

  背景技术 微生物菌种的保存是一项非常重要的工作, 在科研和检测过程中有研究价值的微 生物菌种都需要保存下来, 并且还有很多专业机构专门从事微生物菌种的保存工作。微生 物菌种采用不同的保护剂, 经过不同的方式保存。 保存起来后, 每隔一段时间就需要对菌种 进行抽样, 并测定抽取菌种的存活率及活性, 然后根据存活率及活性情况确定是否可以继 续保存, 或需要复壮后重新保存。该项测定工作, 工作量大, 并要求实验重复性好。

  微生物菌种存活率测定, 即将微生物菌种复活后, 进行计数 ; 微生物菌种活性测 定, 通常是将菌种复活后, 培养一段时间, 定期取样计数, 测定其生长曲线。 两种测定都需要 进行微生物计数, 目前计数方法除了传统的活菌染色显微镜计数、 平板计数等方法外, 还有 浊度法和噻唑蓝 (MTT) 法。前两种传统方法, 耗时长, 操作繁琐, 在大规模、 重复性测定中更 加显得很不方便。浊度法, 其原理是细菌生长, 浊度增加。但是, 由于浊度的分辨率较低, 且不同微生物数量与浊度的关系也不同, 因此常常发生以下两个问题 : 一是, 菌悬液浊度很 低, 但是实际菌悬液中微生物数量已经大量增值 ; 二是, 虽然两种菌浊度数值非常相近, 但 是实际菌悬液中两种菌的数量相差 3 个数量级以上, 从而造成浊度法计数微生物时出现浊 度与微生物数量不一致情况, 因此在大规模、 重复性测定中一般使用得较少。

  MTT 法克服了浊度法的缺点, 其原理是在微生物生长一段时间后, 加入 MTT 和二甲 基亚砜, 终止反应, 产生蓝色, 测定 520nm 处吸收, 其吸收值与微生物数量成正比。但, 目前 采用的 MTT 法均采用终点法检测, 且通过建立的标准曲线进行定量, 实验操作繁琐, 且无法 实现快速的实时检测。

  发明内容 本发明的目的在于提供一种微生物菌种存活率及活性的检测方法, 应用这种方法 可快速、 简便地检测菌种的存活率及活性, 根据检测结果, 如果菌种存活率高、 活性好, 则该 菌种可以继续保存, 如果菌种存活率低或活性低, 则可以通过复壮措施提高其存活率和活 性, 重新保存。

  为实现上述目的, 本发明提供了一种微生物菌种的存活率及活性的检测方法, 其 包括如下步骤 :

  A. 将微生物菌种溶解在含有噻唑蓝的培养液中, 并进行稀释得到菌悬液 ;

  由于只要有活菌存在, 经过培养就能使噻唑蓝产生蓝色物质, 因此可根据出现吸

  收峰的孔的情况, 确定发生生长的最低 3 个稀释度和发生生长的孔数, 例如可通过参考大 肠菌群最大可能数 (MPN) 检索表, 确定菌种中活菌数量。将得到的保存菌种中的活菌数量 除以菌种原先的活菌数量, 可计算得出存活率。

  由于吸收值与菌种生长情况成正比, 因此可根据实时扫描获得的时间 - 吸收曲线 形状判断微生物菌种生长活性。生长曲线可分为三种类型 : 陡峭型、 中间型、 平缓型。陡峭 型, 延滞期短, 对数期几乎呈直线上升, 稳定期维持在较高的吸收值, 且持续时间长 ; 中间 型, 延滞期长, 对数期缓慢上升, 稳定期维持在较低的吸收值, 且持续时间短, 很快进入衰亡 期; 平缓型, 整个曲线呈抛物线型或贴近 X 轴呈直线, 一直维持较低的吸收值。活性好的菌 种为陡峭型生长曲线 ; 活性差的菌种为中间型或平缓型生长曲线。同一菌种不同稀释度的 各孔的生长曲线, 延滞期长短有差别, 但是此后对数期的生长斜率和稳定期的吸收值基本 一致, 从而可以根据生长曲线的类型确定菌种的活性。

  本方法计数的原理是在含有 MTT 的培养基中加入多个 ( 如 8 个 ) 梯度稀释 ( 如 10 倍梯度稀释 ) 的菌悬液, 每个菌株重复数次 ( 如 3 次 ), 培养 24 小时后, 确定发生生长的最 低几个 ( 如 3 个 ) 稀释度和发生生长的孔数 ( 出现吸收峰的孔表示该稀释度有生长 ), 参考 大肠菌群最可能数 (MPN) 检索表, 确定菌种中活菌数量。将本方法得到的保存菌种中的活 菌数量, 除以菌种原先的活菌数量, 可计算得出存活率。 本方法测定活性的原理是, 菌种接种到各孔 ( 如 96 孔 ) 中后, 培养 24 小时, 随着 孔中活菌数量的增加, 蓝色逐渐加深, 其间实时扫描, 测定各孔的吸收值, 做时间 - 吸收曲 线, 用于表征菌种的生长情况。在高等动物细胞中, MTT 被线粒体中的脱氢酶还原成蓝色 Fomazan 颗粒, 因此在进行高等动物细胞数量和活性测定时, 必须加入二甲基亚砜, 使形成 的 Fomazan 颗粒能均匀溶解在细胞悬液中。而在细菌细胞中, 琥珀酸脱氢酶存在于质膜和 间体中, MTT 被细菌活细胞的琥珀酸脱氢酶利用后产生 Fomazan 颗粒, 很容易扩散到菌悬液 中, 且在一定范围内, Fomazan 颗粒形成的量并与细菌细胞脱氢酶活性有关, 也与细菌细胞 数量成正比。因此, 在细菌生长测定时, 可以采取实时扫描方法, 连续测定时间 - 吸收曲线, 吸收值的高低与细菌数量成正比, 因此可以用该曲线表示细菌的生长情况。

  根据本发明的微生物菌种的存活率及活性的检测方法, 所述步骤 A 中的培养液优 选为脑心浸液培养液。所述步骤 B 中的菌悬液的稀释梯度为 10 倍梯度。所述步骤 C 中的 存活率是参考大肠菌群最可能数检索表, 确定保存菌种中的活菌数量, 再将该活菌数量除 以菌种开始保存时的活菌数量, 从而得到存活率。

  将噻唑蓝用 PBS 配置成 5±0.5%的储备液, 灭菌, 冰箱保存 ; 将噻唑蓝储备液加入 脑心浸液培养液中, 使其终浓度达到 0.1±0.05%, 灭菌, 冰箱保存备用 ; 将含有噻唑蓝的 脑心浸液加入到培养板的各孔中 ; 将菌种用脑心浸液培养液溶解后, 用无菌水进行 10 倍梯 度系列稀释 ; 将各稀释度的菌悬液加入微孔中 ; 将微孔板放入酶标仪中, 将培养温度设定 为 36℃, 测定波长为 520nm, 使用动力学测定模式, 每隔一段时间测定一次, 连续测定一定 时间 ; 根据扫描结果计算菌种的存活率、 判断菌种的活性。

  根据本发明的检测方法的一个实施方式, 所述检测方法包括以下步骤 : 将噻唑蓝 用 PBS 配置成 5±0.5%的储备液, 灭菌, 4℃冰箱保存 ; 将噻唑蓝储备液加入脑心浸液培养 液中, 使其终浓度达到 0.1±0.05%, 灭菌, 4℃冰箱保存备用 ; 将含有噻唑蓝的脑心浸液加

  入到 96 孔培养板的各孔中 ; 将菌种用脑心浸液培养液溶解后, 用无菌水进行 10 倍梯度系列 -8 -1 -8 稀释到 10 ; 将 10 -10 稀释度的菌悬液加入微孔中 ; 将微孔板放入酶标仪中, 将培养温度 设定为 36℃, 测定波长为 520nm, 使用动力学测定模式, 每隔 30 分钟测定 1 次, 连续测定 24 小时 ; 以测定时间为 X 轴, 以吸收值为 Y 轴, 作每孔的时间 - 吸收曲线 ; 根据曲线判断菌种活 性; 参考大肠菌群最可能数检索表, 确定保存菌种中的活菌数量, 再将该活菌数量除以菌种 开始保存时的活菌数量, 得到菌种的存活率。

  对于本发明所述的微生物菌种存活率及活性的检测方法, 在测定菌种存活率时, 可将 MPN 法与噻唑蓝显色相结合, 用于测定菌种中的活菌数量。与浊度法相比, 具有更好的 特异性 ; 与传统方法相比, 操作更简便, 使用的试剂更少更经济。 此外, 可利用扫描仪通过实 时扫描获得微生物曲线, 通过曲线的形状可判断微生物活性, 与传统的微生物活性检测方 法相比具有更简便、 更经济的优点。

  也就是说, 本发明提供的微生物菌种存活率及活性的测定方法是通过实时扫描监 控菌种在培养液中的生长情况, 从而定量测定其中的活菌数量, 定性判断活菌的活性。

  本发明尤其适宜于微生物菌种存活率及活性的快速测定, 如发现菌种存活率高, 活性好, 则可以继续保存, 如发现菌种存活率低, 活性差, 可通过菌种复壮手段, 重新保存菌 种。

  按照本发明所述的检测方法的一个实施方式, 该方法采用以下简单过程 : 微生物 菌种溶解在脑心浸液培养基中——将菌悬液进行 10 倍梯度稀释——将含有 MTT 的脑心浸 液培养基加入到 96 孔培养板——将不同稀释梯度的菌悬液加入到各孔中——实时扫描测 定——根据出现吸收峰的情况查 MPN 表, 计算菌种中的活菌数 ; 根据时间 - 吸收曲线形状, 判断菌种的活性情况。微生物菌种溶解到脑心浸液培养液中 ( 除了少部分营养要求特殊的 微生物, 绝大多数微生物菌种都能在营养丰富的脑心浸液培养液中生长繁殖 ), 随着微生物 的生长繁殖, 产生琥珀酸脱氢酶, 分解 MTT, 产生蓝色的 Fomazan。在 520nm 波长下测定光强 度, 作微生物时间 - 吸收生长曲线, 根据出现吸收峰的孔的情况, 确定发生生长的最低 3 个 稀释度和发生生长的孔数, 参考大肠菌群最可能数 (MPN) 检索表, 确定菌种中活菌数量, 将 本方法得到的保存菌种中的活菌数量, 除以菌种原先的活菌数量, 可计算得出存活率 ; 根据 时间 - 吸收曲线形状判断微生物菌种生长活性。如发现微生物菌种存活率与上次检测结果 相比骤降, 或者存活率低于 50%, 或生长曲线呈中间型和平缓型, 则微生物菌种存活率和活 性出现问题, 需要通过菌种复壮手段, 复壮菌种后重新保存 ; 如发现微生物菌种存活率高于 50%, 且与上次检测结果相比变化不显著, 且生长曲线呈陡峭型, 则微生物菌种存活率和活 性高, 可继续保存。

  本发明虽然也采用 MTT 指示微生物生长, 但是使用了多孔板培养微生物, 并实时 扫描测定含有 MTT 的培养液的吸光值变化, 从而简化了实验操作, 提高了检测效率。使用本 微生物菌种存活率及活性实时扫描测定方法, 能够便捷、 快速和高效地定期检测保存的菌 种的存活率及活性。 附图说明

  以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明, 但本发明并不限于这些实施 例。

  本实施例以举例说明的方式对一些菌种进行了实时扫描测定, 但本发明的范围并 不限于本实施例。

  将噻唑蓝用 PBS 配置成 5%的储备液, 灭菌, 4℃冰箱保存。 将噻唑蓝储备液加入脑 心浸液培养液, 使其终浓度达到 0.1%, 灭菌, 4℃冰箱保存备用。 将 180μl 含有噻唑蓝的脑 心浸液加入到 96 孔培养板的每一孔中。打开菌种管, 将菌种用脑心浸液培养液溶解后, 用 -8 -1 -8 无菌水进行 10 倍梯度系列稀释到 10 。按列加入 10 -10 稀释度的菌悬液 20μl 到微孔 中, 每个稀释度重复 3 次, 即 1 株菌种 3 列 ; 每块微孔板 12 列, 可实现 4 株菌种的检测。盖 上微孔板盖子, 将微孔板放入酶标仪中, 将培养温度设定为 36℃, 测定波长为 520nm, 使用 动力学测定模式, 每隔 30 分钟测定 1 次, 连续测定 24 小时。以测定时间为 X 轴, 以吸收值 为 Y 轴, 作每孔的时间 - 吸收曲线。如有相应软件, 可直接采用软件, 制作生长曲线。由于 只要有活菌存在, 经过培养就能使噻唑蓝产生蓝色物质, 因此可根据出现吸收峰的孔的情 况, 确定发生生长的最低 3 个稀释度和发生生长的孔数, 参考大肠菌群最可能数 (MPN) 检索 表, 确定菌种中活菌数量。 将本方法得到的保存菌种中的活菌数量, 除以菌种原先的活菌数 量, 可计算得出存活率。由于吸收值与菌种生长情况成正比, 因此可根据时间 - 吸收曲线形 状判断微生物菌种生长活性。生长曲线可分为三种类型 : 陡峭型、 中间型、 平缓型。陡峭型, 延滞期短, 对数期几乎呈直线上升, 稳定期维持在较高的吸收值, 且持续时间长 ; 中间型, 延 滞期长, 对数期缓慢上升, 稳定期维持在较低的吸收值, 且持续时间短, 很快进入衰亡期 ; 平 缓型, 整个曲线呈抛物线型或贴近 X 轴呈直线, 一直维持较低的吸收值。活性好的菌种为陡 峭型生长曲线 ; 活性差的菌种为中间型或平缓型生长曲线。同一菌种不同稀释度的各孔的 生长曲线, 延滞期长短有差别, 但是此后对数期的生长斜率和稳定期的吸收值基本一致。 从 而可以根据生长曲线的类型确定菌种的活性。如发现微生物菌种存活率与上次检测结果 相比骤降, 或者存活率低于 50%, 或生长曲线呈中间型和平缓型, 则微生物菌种存活率和活 性出现问题, 需要通过菌种复壮手段, 复壮菌种后重新保存 ; 如发现微生物菌种存活率高于 50%, 且与上次检测结果相比变化不显著, 且生长曲线呈陡峭型, 则微生物菌种存活率和活 性高, 可继续保存。

  按照本实施例描述的方法对表 1 所列菌种进行实时扫描测定, 菌种的存活率示于 表1中; 一些菌种的实时生长图谱示于附图中。

  将本方法得到的保存菌种中的活菌数量除以菌种开始保存时的活菌数量, 可计算 8 9 得出存活率。 一般细菌开始保存时的活菌数量通常为 10 CFU/mL ~ 10 CFU/mL, 经过保存后, 与开始保存时的细菌数量相比, 当细菌数量仍为同一数量级, 则认为存活率 100% ; 当细菌 数量减少一个数量级则认为存活率> 10% ; 当细菌数量减少两个或以上数量级则认为存活 < 10% ; 当细菌全数死亡, 则认为存活率为 0%。

  可见, 与现有技术相比, 本发明可便捷、 快速和高效地定期检测保存的微生物菌种 的存活率及活性。

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