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怎样筛选营养缺陷型菌株


来源:澳门葡京      发布时间:2019-11-21 21:38     点击率:

  ①诱变 常用紫外线等物理方法和化学诱变剂等诱变形成大量营养缺陷型菌株。用15W或20W紫外灯管,距离15cm~30cm,照射10sec~20min。在照射受试菌前,灯管须预热20min,使灯光稳定。菌悬液要磁力搅拌,使所有单细胞或单孢子均匀受到照射。特别要注意,应在黑暗或红外光下操作,接种后器皿用黑布包严,防止发生可见光的修复作用。

  a)抗生素法 某些抗生素能杀死生长繁殖着的微生物,而对处于休止状态的微生物无杀伤作用。如青霉素能抑制细菌细胞壁肽聚糖的生物合成,制霉菌素可损伤真菌细胞膜,二者可分别杀死生长繁殖着的细菌、真菌。

  b)菌丝过滤法 适用于放线菌、霉菌等丝状微生物。在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体,而营养缺陷型孢子则不生长。将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中,振荡培养10h~12h,使原养型萌发(以肉眼刚能看见菌丝为度),然后以滤纸、棉花或玻璃过滤漏斗过滤,菌丝被滤除,未萌发的缺陷型孢子能顺利通过,从而达到富集营养缺陷型的目的。

  a)逐个测定法(点种法)把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液在完全培养基上涂布分离,将培养后长出的每一个菌落分别点种在基本培养基和另一个完全培养基上,凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置上能生长的菌落,表明其为营养缺陷型。

  b)夹层培养法经诱变处理后的菌液,稀释后与基本培养基混匀并倾入平皿中,待凝固后,再加上一薄层不含菌的基本培养基。培养后在皿底将长出的菌落做上标记。然后加上一层完全培养基,再经培养后,新出现的菌落多数是营养缺陷型(图3-31)。此法适用于兼性厌氧的细菌。

  C)影印法 将丝绒包在直径小于平皿的圆柱台上,固定,作为影印接种工具,灭菌备用。将经诱变处理并淘汰野生型的菌液涂布于完全培养基表面上,培养,待长出菌落后,用影印接种工具在此平板上轻按一下,然后在另一基本培养基平板上按一下。经培养后在基本培养基上不长而在完全培养基的相应部位上生长的菌落,为营养缺陷型。

  ④鉴定营养缺陷型——生长谱法 将检出的缺陷型菌株接种在完全培养基上培养,把生长的菌体或孢子洗下,离心清洗后制成浓度为107个/ml~108个/ml的菌悬液。取0.1ml该悬液与基本培养基混匀倒皿,冷凝并稍干燥后,分区加沾有各种营养物的圆滤纸片,培养,观察生长反应。

  在筛选营养缺陷型的过程中必须注意表型延迟现象。由于诱变剂一般仅作用于DNA的某一单链,故突变无法反映在当代的表型上,需经DNA复制和细胞分裂后,才使表型发生变异,此即表型延迟现象。

  二.富集和分离抗生素敏感菌的营养缺陷型突变株的抗生素法 将抗生素加入原养型培养基(即培养基中缺少营养缺陷型所需的养分)中,能杀死生长中的野生型细胞,而不能生长的突变株得以幸免。

  抗生素敏感菌营养缺陷型菌株的筛选过程①菌悬液诱变处理。②死的和活的野生型细胞及一些活的前突变细胞的混合液在C.M.中培养,使已发生营养缺陷突变的细胞的缺陷表型得以充分表现。若无这一阶段的培养,则许多细胞的基因型虽已改变,但表型仍和野生型一样,这些突变细胞在以后接触抗生素时也将被杀死。③在无氮培养液中培养,使营养缺陷型菌株细胞内所含养料尽量消耗,以便停止其生长繁殖。④在含抗生素的M.M.中培养,杀死能生长的野生型菌株。⑤检出缺陷型。⑥鉴定缺陷型.

  三.营养缺陷型在科研和生产实践中的应用在科学研究中,营养缺陷型既可作为研究代谢途径和杂交、转化、转导、原生质体融合等遗传规律所必不可少的标记菌种,也可作为氨基酸、维生素或碱基等生物测定的试验菌种。在生产实践中,营养缺陷型可作为菌种杂交、重组育种和构建工程菌时所不可缺少的带有特定基因标记的亲本菌株,它们还常被用作生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株。由于营养缺陷型在代谢途径中某一步骤发生缺陷,致使终产物不能积累,从而遗传性地解除反馈抑制,使中间代谢产物或另一分支途径的末端产物得以积累。

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