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ctDNA 测序进行癌症早筛的机遇和挑战


来源:澳门葡京      发布时间:2019-12-07 00:15     点击率:

  根据 2018 年世界卫生组织公布的数据,癌症年发病例数约 1810 万,癌症死亡人数接近 1000 万。在中国,每天有 1 万人确诊癌症,平均每分钟就有 7-8 个人被诊断为癌症。癌症给个人及家庭带来了巨大的精神压力和经济损失,同时也给国家和社会造成了沉重的医疗负担。

  癌症发现越早,五年生存率就越高,患者不仅可以获得更长的生存期,也可以大幅度提高生存质量。按照肿瘤临床分期不同,患者的五年生存率有很大差异。以肺癌为例,I 期肺癌患者五年生存率可达到 80% 以上,而晚期肺癌患者的五年生存率不足 20%。

  目前各个国家都已经行动起来,把癌症早筛及预防作为重大问题处理。按照我国「健康中国 2030 年」的规划,到 2030 年我国整体癌症死亡率要下降 15%。2019 年初,李克强总理主持召开了国家的癌症早诊早治工作会议,专门讨论了加强早诊早治、加强科普宣传、在高发地区锁定高危人群进行癌症筛查等重大战略级议题。

  近年来肿瘤领域的研究热点 ctDNA(circulating tumor DNA,循环肿瘤 DNA)检测,已经在伴随诊断领域大放异彩,随着它在临床实用性上的价值确认,目前它被寄予厚望,研究重心逐步前移到肿瘤超早期筛查上。癌症的发生并不是一蹴而就,从最初分子层面的改变到癌前病变到医学影像学可见的恶性肿瘤,需要经过一个漫长过程。以肠癌为例,从最初增生到小腺瘤、大腺瘤、重度非典型增生,最后发展为肠癌大约需要 10-20 年的时间。研究表明,几乎所有的癌症都是由基因突变引起。而 ctDNA 是由肿瘤细坏死、凋亡或者正常分泌到血液中 DNA 片段,其携带了癌症相关的基因变异信息,在肿瘤分子层面发生变异时就可检测到,所以可以用于癌症的早期检测。预计到 2021 年前后,基于液体活检的癌症早筛项目将逐步应用于三级甲等医院和高端体检中心,并快速向下渗透。

  从技术标准的确立、临床指南的认可、法律法规的制定到大众接受度,任何新技术的发展和应用都需要一个漫长的过程,尤其在临床医学领域。液体活检在肿瘤早筛方面的应用亦是如此,目前液体活检还处于初期发展阶段,却展示了巨大的发展潜力,液体活检本身的实际价值、各类研究成果的不断发布、资本的热捧,都使液体活检成为了一颗璀璨的明星。但同时,由于基础研究的滞后性、行业规范缺乏等,也相继产生了一些问题。可以说,液体活检可以说相当于一把双刃剑,如果应用的好,将会给人类健康带来巨大的价值;反之,可能会引起行业混乱,最终葬送了美好的前程。这里我们就 ctDNA 突变在肿瘤早筛方面的应用为例来介绍一下目前在应用中存在的问题等,希望行内的专家、普通大众都理性对待这个在对抗癌症方面有巨大潜力的工具,让其沿着正确的轨道发挥它自身的价值,从而让大众最大获益。

  ctDNA 是属于血液循环游离 DNA(cell-free DNA)的一种,所占比例在 0.01%-90% 左右。最早在临床上应用的 cfDNA 检测的技术是我们目前熟知的无创产前诊断(non-invasive prenatal test,NIPT),研究发现在母体内可以检测到胎儿的游离 DNA 片段,进而产生了 NIPT 用于产前诊断。类似的原理(胎儿和实体瘤均可理解为主体上生长的异物),我们也可以通过检测血液中 ctDNA 突变信息,来进行肿瘤的早期筛查、判断占位性病变的良恶性及检测肿瘤术后复发情况等。可以说 ctDNA 检测在肿瘤医学中的应用依赖于基础研究与检测技术的结合,目前随着各种高通量检测技术的发展(组学、二代测序等),检测技术的发展突飞猛进;而基础研究则相对滞后,如 ctDNA 的组分、结构、代谢路径等等,这些基础问题尚未阐明。所以,目前 ctDNA 泛癌早筛机遇与挑战同时存在。

  传统癌症诊断方法集中在我们肉眼可见阶段,很多患者确诊时已是晚期,治疗效果很差。随着科技的发展和研究的深入,研究者们将精力转向前端,通过早筛早诊来提高癌症的治疗效果,降低死亡率。液体活检进行癌症早筛就是通过检测基因分子层面的变异信息,对大众健康进行提前预警。因为癌症早筛需要检测基因范围很广,所以目前国际上和行业内公认的泛癌早筛策略是多基因、多位点的大 panel 检测。作为液体活检领域的行业巨头 Grail,目标就是以 ctDNA 测序为基础,通过检测血液中 ctDNA 的含量,实现多癌种的早期筛查。所以其从成立之初就开始了大家熟知的「CCGA」临床试验,收集了来自美国和加拿大临床上至少 15,000 名参与者,通过对 507 个基因 panel、全基因组测序及全基因组甲基化等技术进行肿瘤早筛。2017 年一年的时间,美国 FDA 就批准了两项大 panel 进行基因检测的项目,一个是纪念斯凯隆特琳癌症研究中心(MSK)的癌症基因检测分析平台 MSK-IMPACTTM 用于癌症患者 468 个基因检测;另外一个是 FDA 跟医疗保险和医疗补助服务中心(CMS)同时批准 Foundation Medicine 公司旗下产品——FoundationOne CDx(F1CDx)用于泛癌症临床伴随诊断。

  目前检测基因变异的方法有很多,比如包括扩增受阻突变体系(amplification refractory mutation system, ARMS)、PCR 法、NGS 二代测序法等,每一种技术都有各自的优势,可以适用于不同的检测中。根据我国 2018 年「液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识」,针对未知突变的发掘,NGS 方法具有其他方法无可比拟的技术优势。检测患者 ctDNA 已知的部分或全部临床药物治疗靶点谱或耐药指示靶点谱,或发现患者基因未知突变、探索临床价值与相关机制时建议使用 NGS 方法。目前选择检测方法涉及到几个位点或者十几个位点的检测,可以考虑数字 PCR(ddPCR)、ARMS 法;如果涉及的位点是几十上百个或更多,则建议使用 NGS 的方法。在 2018 年我国国家食品药品监督管理总局也批准了「NGS」第一证,说明 NGS 在液体活检领域的应用在我国受到了认可。泛癌早筛涉及多基因、多位点的检测,所以 NGS 是目前最合适的泛癌早筛方法。包括 Grail 以及国内大部分从事癌症早筛的公司都是使用 NGS 法进行早筛检测。

  ctDNA 含量少、降解快,在前期样本提取和处理过程中极易降解。无症状个体的 cfDNA 中只有约万分之一的比例为 ctDNA。ctDNA 半衰期很短,仅仅 0.5-1 小时,因此抽血后需要尽快分离提取,否则可能会增加检测的假阴性率;另外,样本处理过程中若操作不当容易导致白细胞破裂,其释放的基因组 DNA 混入 cfDNA、进一步导致 ctDNA 所占比例下降,这意味着检测的假阴性率进一步提高。整体而言,从血液采集、运输、到 ctDNA 分离提取、建库测序这一系列的实验操作中都有影响结果正确性的风险存在。因此,ctDNA 检测要想成为具有临床应用性的技术,就需要遵照规范 SOP、在具有资质的实验室进行。避免再次出现 2017 年底关于「美国两家顶尖基因检测公司为同一批患者做的液体活检,结果大相径庭」的现象。

  如果不考虑当前 NGS 测序平台的仪器局限性、单就样本特征而言,ctDNA 分析方法的检测极限受两个重要因素影响,即 cfDNA 分子数量、病人肿瘤中的突变负荷。有研究表明,10 ml 来自无症状人体的血液中大约可分离获得 4-5 ml 血浆,理想情况下可得到 15-30 ng cfDNA,相当于来自 2500-5000 个基因组当量的模板,按照实验过程中 50% 的得率进行计算,最终参与检测的模板数为 1250-2500 个,当 ctDNA 的占比约为 0.1% 时,理论上现有水平可以检测到所有的变异。另一方面,肿瘤的体积与变异等位基因频率(VAF)呈正相关,肿瘤分期越早,ctDNA 含量越低,需要的检测手段要求灵敏度就越高。市面上用药指导检测(如 EGFR)产品的灵敏度在 0.5-3% 之间,癌症早筛检测需要的灵敏度相对更高。目前行业内研究者普遍认为对早筛优于 0.01% 的灵敏度最合适。另外,二代测序背景噪声高,用常规建库测序方法很难检测到肿瘤信号。要解决这个问题,研究者们以及各家公司从不同角度进行了尝试,比如提高捕获效果、加分子标签等,可以说各种技术百花齐放。但目前没有哪家公司的技术有绝对优势,目前最好只能做到 0.03-0.05% 左右。这方面目前最好的办法是尽量参考国际领先技术,比如斯坦福大学的 CAPP-Seq(cancerpersonalized profiling by deep sequencing)技术,也就是后来被称为「集成数字错误抑制(IDES)」的方法。

  除此而外,测序深度也是重要因素。比如 Grail 公司开展的 507 个基因的 panel 泛癌筛查试验,测序深度高达 60000×(有效测序深度至少达到上千乘才有可能检测到低丰度突变)。这也可以解释为什么市面上基于 NGS 技术的 ctDNA 检测产品售价动辄就上万元。如按照 Grail 的标准进行几万乘的测序,就算只做大 panel 靶向测序,使用性价比最高的 NovaSeq 平台,1 G 数据量按 60 RMB 计算,单测序成本也已经有几千 RMB。

  ctDNA 突变进行泛癌早筛的另一难题是对检测到的阳性结果进行器官定位,因为大部分原癌基因和抑癌基因的突变都没有组织特异性,均与多种癌症的发生发展有关系。比如 KRAS 基因突变与胰腺癌和非小细胞肺癌都有很大的相关性,所以通过检测这些变异,我们无法知道肿瘤病灶在什么器官、什么部位。因此,ctDNA 突变的阳性结果目前需要使用临床、放射学等方法结合进行全面的随访调查,以确定肿瘤的位置。考虑到 ctDNA 突变筛查通常是癌症诊断的第一步,且有假阳性存在,这样的随访可能会增加医疗保健系统的负担。所以研究者们希望研发出一种基于 cfDNA、能够同时检测肿瘤并预测其组织来源的方法,已取得了一些成果。

  2017 年发表在 Genome biology 杂志上的癌症定位器(CancerLocator)分析法,通过利用癌症基因组图谱(TCGA)中 DNA 甲基化数据将癌症患者的血浆 cfDNA 建模,癌症定位器使用信息特征来计算血浆中 ctDNA 的比例,以及检测到的 ctDNA 来自每种肿瘤类型的可能性。基于这些结果,癌症定位器最终决定病人是否有肿瘤以及原发肿瘤的位置。该研究的局限性在于研究者使用实体肿瘤组织的 DNA 甲基化数据来训练模型,由于 DNA 甲基化芯片只关注启动子区域,这样可能会错过癌症的重要特征区域。另外,该研究通过比较正常血浆 cfDNA 和肿瘤 DNA 的甲基化谱来确定标记物,这一过程可能会引入组织特异性而非肿瘤特异性的标记物。

  2018 年发表在 Science 杂志上的 CancerSEEK 检测结果,通过检测血液中蛋白质标志物和 ctDNA 突变进行癌症早筛,并能将研究中 83% 的患者的癌症起源组织定位在两个解剖部位。这是为数不多的正式进行癌症溯源的研究,但是这个研究也有一些局限性,比如,患者群体由已知癌症患者组成,大多数是根据疾病症状诊断的。其次,该研究的对照组仅限于健康个体,而在真正的癌症筛查中,有些个体可能患有炎症或其他疾病,尤其是传统肿瘤蛋白标志物特异性低,因为肿瘤来源器官的炎症等病程会造成假阳性。

  从这些研究我们不难看出,癌症溯源在未来应该是可以实现的。由基础研究阐明基因突变与器官组织癌变机理的关系,结合突变、甲基化、蛋白(肿瘤抗原、肿瘤抗体)、影像学等因素,采用人工智能学习等技术手段,通过多学科的综合应用、大规模的临床数据积累,我们有可能在早期找到癌症的原发部位。

  我们相信上述两个问题解决之时就是癌症早筛产品成熟之日。但这是一个耗时耗财的过程,不是短期可以实现的。Grail 从成立至今已经通过 A、B、C 三轮融资,总融资额达到 13 亿美元。到目前为止,在这两个问题上仍没有很好的成果,一直在投入大量的资金进行临床研究(比如 Grail 单癌种的早筛检测计划招募 10 万志愿者参与)。所以,泛癌早筛,任重而道远。但我们坚信泛癌早筛,未来可期。

  ctDNA 突变检测显示出足够的分析效度,下一步就是证明临床效度,最重要的是临床应用。这直接影响到临床医生和患者是否会选用该检测。从根本上讲,有两种模式可以证明 ctDNA 的临床应用,并将其作为一种临床有用的检测手段,我们在评估产品或者服务时可以参考。最可靠的是前瞻性临床试验,目前在泛癌早筛方面的前瞻性临床试验并不多,大家熟知的就是 Grail 的「CCGA」临床试验,泛癌筛查计划入组 15000 人,随访时间大于 5 年;第二个策略是回顾性分析,评估 ctDNA 检测结果是否能提供与组织基因组评估相同的信息,如果组织基因组评估已被证明具有高水平的临床应用证据,则只需要证明 ctDNA 检测与肿瘤组织基因分型高度一致,就可能为 ctDNA 检测提供较易被接受的实用证据------尽管这种思路的逻辑基础没有考虑肿瘤组织的采样异质性问题,但这是现阶段较容易被临床医生接受的切入点。

  阳性预测值(PPV)等于真阳性例数 /(真阳性例数 + 假阳性例数),也就是说预测出来的所有阳性中,有多少是真阳性。目前,大家对前两者的熟悉度和关注度相对较高。其实 PPV 也同样重要,PPV 的意义在于考虑了实际人群患病率,阳性预测值越高,说明真正为病人的可能性很大。阳性预测值与灵敏度、特异性和患病率均有关系,了解阳性预测值,有助于我们深入分析临床结果,了解受试者的真实情况。首先,患病率越高,阳性预测值越高,这说明如果我们在高危人群中进行检测可以得到更有效的检测结果,从而避免过度诊疗。另外,在临床上拿到诊断结果时,需要根据其人群患病率,进行综合判断。最后,在患病率相同的情况下提高特异性比提高灵敏度更有助于提高阳性预测值。从上述内容可以看出,PPV、灵敏度和特异性三者关系紧密,我们在进行 ctDNA 早筛试验时要尽量平衡三者之间的关系,寻找最佳平衡点,不可一味追求其中一项指标。

  很多癌症都有术后复发的情况,尤其术后 3 年是复发高峰。如果及早发现术后复发,及时干预可以延长患者的寿命,甚至有治愈的可能。但是癌症术后复发监测不能和癌症早筛划等号。癌症早筛是针对健康人群进行癌症筛查,看体内是否含有癌变的信息,以便进行及早干预,重点是「广」的问题。而术后复发监测是检测经过手术等治疗后的患者体内是否有癌症复发的可能,除了「广」还需要「深」。而且研究表明,不同癌种 ctDNA 水平和标准不同、术后监测到的时间也不同,比如同样是乳腺癌患者,Lin 博士的研究发现,通过 ctDNA 对不同亚型的患者进行术后监测,结果显示 HR+/HER-型平均可以提前 301 天检测到;而 HER+型平均提前 164 天。所以癌症早筛与术后复发监测不可使用同一个 panel 检测。术后复发监测最合理的办法是针对不同的癌种,专门设计与之最相关的基因的 panel。于术前或者诊断时收集组织样本、血液样本做参照,采集术后血进行实时监控,然后通过大规模临床验证。从目前的技术来讲,这样可以给患者提供最准确的检测。

  正常人体内也携带大量非致病性的基因突变,且随着年龄增加突变数量也增加,有研究表明,20 岁时,每个人的正常食管上皮细胞平均携带几百个突变,到生命后期每个细胞携带突变超过 2000 个。因此,癌症筛查技术需具备慧眼识珠的能力,从非致病的体细胞基因突变中挑选出癌症相关的基因变异。如何使这个过程变得精准而简洁?最根本的需求是有一个比对标准,即汇集无症状人群突变数据、形成可供参比的基线,以实现非致病性突变和癌症相关突变的分离,从而挑出靶基因的靶变异。所以健康中国人基线数据对我国的精准癌症早筛有非常重要的意义。

  约翰霍普金斯大学著名癌症遗传学家 Bert Vogelstein 曾经说过:「战胜晚期癌症最好的方法是阻止其发生,未来,当癌症和死于癌症变得不那么常见的时候,很多原因将是由于早期发现,而不是因为我们可以治愈一个布满肿瘤的身体。」我们相信液体活检是一个潜力非常大的癌症早筛的工具,希望我们利用现有的高科技,利用现有的液体活检技术,为我们的临床做出更大贡献。

  11. 支修益教授在 2019 年 3 月 2 号「深圳第一届肿瘤预防与早筛高峰论坛暨第七届鹏城肿瘤生物治疗论坛」上关于《人工智能 AI 在肺小结节诊疗中的应用》的报告。

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