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基因组高通量测序的原理


来源:澳门葡京      发布时间:2019-12-10 07:39     点击率:

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  测序方案建立在双脱氧测序法(Sanger等,1977)的基础上。为了从每一克隆插入片段两端成对地进行测序,每一个质粒模板DNA板应配备两个384孔循环测序反应板。

  机械臂负责等分模板试样,起与反应液混合的作用,反应液含有双脱氧核苷酸、荧光标记的核苷酸、TaqDNA聚合酶、序列引物和缓冲液。

  模板和反应板有条形码,且在BiomekFX移液操作工作站上有条形码读取器跟踪,确保模板和反应液转移中没有错误。30~40线性扩增步骤连续循环在MJResearchTetrads或9700热循环仪(Ap—pliedBiosystems)中进行。

  测序方案建立在双脱氧测序法(Sanger等,1977)的基础上。为了从每一克隆插入片段两端成对地进行测序,每一个质粒模板DNA板应配备两个384孔循环测序反应板。测序反应采用Big Dye Terminator chemistry version 3.1(AppliedBiosystems)和标准M13或常用正向引物和反向引物。测序反应通过BiomekFX(Beckman)移液操作工作站建立。机械臂负责等分模板试样,起与反应液混合的作用,反应液含有双脱氧核苷酸、荧光标记的核苷酸、TaqDNA聚合酶、序列引物和缓冲液。模板和反应板有条形码,且在BiomekFX移液操作工作站上有条形码读取器跟踪,确保模板和反应液转移中没有错误。30~40线性扩增步骤连续循环在MJResearchTetrads或9700热循环仪(Ap—pliedBiosystems)中进行。反应产物可以用异丙醇在室温下高效率沉淀,4C下保存或悬浮在水中密闭保存。如果测序仪器正常,在扫描反应板的条形码后,会自动为每一反应板生成一个样品膜。然后将反应板移至一台ABIPrism3700DNA分析仪或AppliedBiosystems 3730xiDNA分析仪上,进行电泳。现在的多聚体和软件允许每天在ABIPrism 3700 DNA分析仪上进行8次电泳,在AppliedBiosystems 3730xlDNA分析仪上进行12次,调试时间少于1h。

  平行运行大量工作的高通量测序设备通常需要通过实验室信息管理和样品跟踪系统(1aboratory information management and sample tracking system,LIMS)(Kerlavage等,1993)进行自动化管理。在TIGR,这种系统包括从文库构建早期经测序到结束的样品跟踪的整套软件。经过这种处理,数据保存在Sybase关系数据库表格中。数据库储存和联系在整个基因组测序流程中所收集的全部数据,允许使用者以各种方式回溯数据流,可从已经注释的基因回溯到基因的原始测序跟踪文件。这个系统包括样品管理、数据输入、文库管理和序列加工的客户端/服务器应用软件。经过多年改进,并且结合新的实验室方法、新型的仪器和软件,这一系统已成熟稳定。这些整合应用包括自动载体清除、确定和屏蔽重复元件、发现污染的克隆和跟踪克隆及模板信息。

  在测序流程中,生成的模板和序列的质量每天可通过用户友好界面系统地监控。这就保证了迅速发现并改正工作中的潜在问题。通常,质量控制和质量测评(qualitycontrol/qualityassessment,QC/QA)组共同应用质量检测标准。他们负责检验和提供试剂给生产组,并在流程中检测模板质量、调查失败和偏离正常表现范围的情况、监控数据质量、审计、确定可改进的方面、制作控制文件(标准操作步骤),以保证这些文件具有格式上的一致性和技术上的准确性。

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